Evaluación de oligonucleótidos para la identificación por PCR en punto final de plagas de interés agrícola

Abstract

Currently, a significant number of molecular techniques have been reported for the detection and identification of microorganisms and other pathogenic organisms in plants, being the polymerase chain reaction (PCR) the most widely used technique, while first generation sequencing is emerging as a technique of great applicability. Molecular methods do not constitute standardized protocols useful for the amplification of any gene, which makes their use difficult in some cases. For this reason, hard work must be done to overcome such limitations (Palomino & González, 2014). Currently, for various crops of economic interest, Senasica has under surveillance 5 pests identified as high risk, including fungal species such as Phytophthora capsici and Fusarium oxysporum, Grapholita molesta insects, Commelina benghalensis weeds and Meloidogyne Chitwoodi nematodes. Of the aforementioned pest species, the correct identification of these species plays an important role in making decisions regarding their management. Therefore, it is important to make use of advances in molecular biology in relation to methods of identification and characterization of pests and diseases based on the use of molecular markers such as the 18S gene, which was used as a molecular marker in the course of this social service. The general objective of this social service project was to standardize the PCR endpoint reaction using two sets of specific oligonucleotides for the 18S ribosomal gene, in order to identify the species provided by the different laboratories of the National Center of Phytosanitary Reference (CNRF). The specific objectives were: ● To evaluate the quality and concentration of DNA samples for. PCR analysis. ● To standardize the optimal conditions for the amplification of two fragments of the 18S gene from Phytophthora capsici and Fusarium oxysporum Fusarium oxysporum species, Grapholita molesta insects, weeds Commelina benghalensis and Meloidogyne chitwoodi nematodes. ● Confirm via Sanger sequencing the identity of the obtained amplicons. obtained.

Actualmente se ha reportado un número significativo de técnicas moleculares para la detección e identificación de microorganismos y otros organismos patógenos en plantas, siendo la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) la técnica más utilizada, mientras que la secuenciación de primera generación se perfila como una técnica de gran aplicabilidad. Los métodos moleculares no constituyen protocolos estandarizados útiles para la amplificación de cualquier gen, lo que dificulta su utilización en algunos casos. Por esta razón se debe trabajar arduamente para superar tales limitaciones (Palomino & González, 2014). Actualmente, para diversos cultivos de interés económico, en la Senasica se tiene bajo vigilancia 5 plagas identificadas como de alto riesgo, entre las que se encuentran especies de hongos como Phytophthora capsici y Fusarium oxysporum, insectos Grapholita molesta, malezas Commelina benghalensis y nemátodos Meloidogyne Chitwoodi. De las especies de plagas mencionadas, la correcta identificación de éstas juega un papel preponderante para la toma de decisiones en cuanto a su al manejo de estos. Por tanto, es importante hacer uso de los avances en la biología molecular en relación con métodos de identificación y caracterización de plagas y enfermedades basados en el uso de marcadores moleculares como son el gen 18S, el cual fue utilizado como marcador molecular en el curso de este servicio social. El objetivo general de este proyecto de servicio social fue estandarizar la reacción de PCR punto final utilizando dos juegos de oligonucleótidos específicos para el gen 18S ribosomal, con la finalidad de identificar a las especies proporcionadas por los diferentes laboratorios del Centro Nacional de Referencia Fitosanitaria (CNRF). Los obejtivos especificos fueron: ● Evaluar la calidad y concentración de muestras de DNA para análisis vía PCR. ● Estandarizar las condiciones óptimas para la amplificación de dos fragmentos del gen 18S de las especies Phytophthora capsici y Fusarium oxysporum, insectos Grapholita molesta, malezas Commelina benghalensis y nemátodos Meloidogyne chitwoodi. ● Confirmar vía secuenciación Sanger la identidad de los amplicones obtenidos.