Estandarización del protocolo para separar leucocitos en sangre de Ambystoma mexicanum usando gradiente de Ficoll.

Abstract

El ajolote (Ambystoma mexicanum) es un anfibio endémico del Valle de México que través de los años se ha convertido en un modelo de investigación sobre el desarrollo y la regeneración, sin embargo, no existen protocolos para llevar a cabo una separación leucocitaria en anfibios y específicamente en ajolotes; esta es vital para realizar estudios para comprender las funciones celulares y la caracterización de cada población leucocitaria , por lo que la finalidad de esta investigación fue estandarizar un protocolo para separar leucocitos de sangre periférica del ajolote que pueda usarse para realizar investigaciones más a fondo sobre los mismos. La población de estudio y la recolección de muestras sanguineas se llevó a cabo en el CIBAC, los individuos muestreados tenían 3 años de edad con un peso promedio de 165 gr. En un tubo cónico se agregaron 0.5 mL de sangre que se diluyeron con 0.5 mL de PBS para anfibios (Amphibian PBS). En otro tubo se colocó 1 mL de gradiente de Ficoll-Paque PLUS al que se le agregó la sangre diluida encima, asegurándose de que esta quedara sobre el Ficoll. Este tubo se centrifugó a 1200 rpm (225 g) durante 10 min a temperatura ambiente. Después de centrifugarlos se separó la interfase y se pasó a un tubo eppendorf al que se le agregó PBS de anfibios y se lavó tres veces durante 3 min a 4000 rpm. Finalmente las células obtenidas fueron resuspendidas en 30 μL. Este protocolo se modificó en base a los resultados obtenidos al comprobar la pureza de las fracciones la cual se determino realizando frotis con la porción celular obtenida y llevando a cabo conteos a 100 células evaluando las características morfológicas y diferenciando los leucocitos