Estandarización de la prueba de TUNEL para identificar muerte por apoptosis durante el periodo crítico de la diferenciación sexual hipotalámica de ratas provenientes de madres hiperglucémicas

Abstract

La prueba de TUNEL es una herramienta que permitió identificar apoptosis en el periodo crítico de la diferenciación sexual hipotalámica de ratas que provenían de madres hiperglucémicas por lo que es una herramienta altamente sensible y confiable. Para evaluar el proceso de apoptosis se hizo a partir de dos grupos de ratas: un grupo al que se le aplicó propionato de testosterona (HPT) y otro grupo control al que se le aplicó solución salina (HCTRL) en un tiempo de 1, 3 y 6 horas postnatales para ambos grupos. Ambos grupos mostraron ausencia de señal de apoptosis lo que confirma la integridad del ADN (grupos negativos). Aunado a esto, se implementó un tratamiento con DNasas al grupo HPT. Las DNasas son enzimas que se encargan de degradar el ADN por lo que en la prueba de TUNEL se pudo identificar apoptosis en los 3 tiempos pero siendo más evidente a las 3 y 6 horas y con ello confirmar la sensibilidad y confiabilidad de la prueba; además, se evaluó la expresión del receptor FAS y Citocromo C que permitió reforzar la prueba. La proteína FAS es un receptor de muerte perteneciente a la familia del Factor de Necrosis Tumoral (TNF) cuya activación desencadena la vía apoptótica extrínseca mediante la activación de caspasas iniciadoras como la caspasa 8. Por otro lado, Citocromo C es una proteína que se encuentra en el espacio intermembrana de la mitocondria y su detección en el citoplasma de las células hipotalámicas sugiere la activación de la vía apoptótica intrínseca. La identificación de ambas proteínas en los 3 tiempos refuerza la prueba de TUNEL y se comprueba que es una excelente herramienta capaz de identificar apoptosis. Finalmente, en el análisis del núcleo sexualmente dimórfico de la región preóptica medial se aprecia más desarrollado en los individuos tratados (HPT) que en los individuos control (HCTRL) y esto complementa y da respuesta a las señales de apoptosis obtenidas en las prueba de TUNEL ya que el grupo HPT se observaron neuronas de mayor tamaño relativo, citoplasma más eosinófilo y núcleos más grandes ya que en esta área el propionato de testosterona evita la apoptosis en comparación del grupo HCTRL donde sucede lo contrario.