Secuenciación sanger de regiones genómicas metiladas con técnica de bisulfito en muestras de madres con diabetes gestacional

Abstract

El presente informe describe el desarrollo de un proyecto de investigación enfocado en el análisis de regiones genómicas metiladas en muestras de madres con diabetes gestacional (DG), utilizando técnicas de conversión con bisulfito, PCR y secuenciación de Sanger. La diabetes gestacional representa una de las alteraciones metabólicas más frecuentes durante el embarazo y constituye un importante problema de salud pública debido a sus repercusiones maternas y fetales, así como al incremento del riesgo de desarrollar diabetes tipo 2 en etapas posteriores. En este contexto, el estudio se centró en el análisis del gen SLC16A11, identificado como un factor de riesgo relevante para enfermedades metabólicas en población latinoamericana. El objetivo principal consistió en generar y secuenciar regiones genómicas metiladas mediante técnicas moleculares aplicadas a muestras de sangre periférica de mujeres con diagnóstico de diabetes gestacional. Para ello, se realizó la separación de células mononucleares mediante gradiente de densidad con Ficoll, seguida de la extracción de ADN genómico. Posteriormente, el ADN fue sometido a conversión con bisulfito, con la finalidad de diferenciar citosinas metiladas de no metiladas. Las muestras tratadas fueron sometidas a amplificación por PCR y análisis mediante electroforesis en gel de agarosa. Sin embargo, no se observó amplificación específica de las regiones de interés, por lo que tampoco fue posible obtener resultados de secuenciación de Sanger. A pesar de ello, la amplificación exitosa del gen constitutivo β-actina confirmó que el ADN genómico original se encontraba íntegro, sugiriendo que las dificultades observadas estuvieron relacionadas principalmente con la degradación y reducción de complejidad del ADN posterior al tratamiento con bisulfito. Los resultados permitieron identificar importantes limitaciones técnicas asociadas al análisis de metilación del ADN, particularmente en la eficiencia de amplificación y secuenciación. Asimismo, el estudio destacó la necesidad de optimizar variables experimentales como la concentración inicial de ADN, las condiciones de conversión con bisulfito y el diseño de primers específicos. Finalmente, este trabajo contribuye al fortalecimiento de metodologías de biología molecular aplicadas al estudio epigenético de enfermedades metabólicas y aporta bases para futuras investigaciones relacionadas con la diabetes gestacional.

This report describes the development of a research project focused on the analysis of methylated genomic regions in samples from mothers with gestational diabetes mellitus (GDM), using bisulfite conversion, PCR, and Sanger sequencing techniques. Gestational diabetes represents one of the most frequent metabolic disorders during pregnancy and constitutes an important public health issue due to its maternal and fetal repercussions, as well as the increased risk of developing type 2 diabetes later in life. In this context, the study focused on the analysis of the SLC16A11 gene, identified as a relevant risk factor for metabolic diseases in the Latin American population. The main objective was to generate and sequence methylated genomic regions through molecular techniques applied to peripheral blood samples from women diagnosed with gestational diabetes. For this purpose, mononuclear cells were separated using a Ficoll density gradient, followed by genomic DNA extraction. Subsequently, the DNA was subjected to bisulfite conversion in order to differentiate methylated from unmethylated cytosines. The treated samples underwent PCR amplification and agarose gel electrophoresis analysis. However, no specific amplification of the regions of interest was observed, and therefore it was not possible to obtain Sanger sequencing results. Despite this, the successful amplification of the constitutive β-actin gene confirmed that the original genomic DNA remained intact, suggesting that the observed difficulties were mainly related to DNA degradation and reduced complexity after bisulfite treatment. The results made it possible to identify important technical limitations associated with DNA methylation analysis, particularly regarding amplification and sequencing efficiency. Likewise, the study highlighted the need to optimize experimental variables such as the initial DNA concentration, bisulfite conversion conditions, and the design of specific primers. Finally, this work contributes to strengthening molecular biology methodologies applied to the epigenetic study of metabolic diseases and provides a basis for future research related to gestational diabetes.