El Papel de FoxO3a y las Especies Reactivas de Oxigeno (ROS) en la Apoptosis, en Fibrosis Pulmonar Idiopatica (FPI) y Neumonitis por Hipersensibilidad (NH)

Abstract

La subfamilia FoxO de factores de transcripción se caracterizan por un dominio de unión al ADN denominado caja forkhead. Entre ellos, FoxO3a es uno de los factores transcripcionales que esta involucrado en diversas patologías como la FPI y NH. Además, estos factores han demostrado desempeñar un papel esencial en diversos procesos biológicos, incluidos el desarrollo, la proliferación, la apoptosis, el metabolismo, la diferenciación, y en la defensa contra el estrés oxidativo. El H2O2 es una molécula de vida corta que se genera como subproducto de la respiración celular, podría funcionar como mensajero especifico modificando moléculas diana o cambiando el estado redox intracelular. En este trabajo se evaluó el papel de FoxO3a como un regulador en la expresión de genes de carácter pro-apoptótico en células controles y células obtenidas de biopsias de pacientes diagnosticadas con FPI y NH que se sometieron a un estimulo estresante, utilizando peróxido de hidrogeno (H2O2) a una concentración y tiempo de exposición establecidos para provocarles estrés oxidativo. Para esto se obtuvieron fibroblastos a partir de biopsias de pacientes diagnosticados con FPI y NH y por otra parte se realizaron cultivos de líneas celulares control, en medio de cultivo EMEM enriquecido al 10% de suero bovino fetal y antibiótico Primocin. Se estimularon con H2O2 tanto líneas control cómo patológicas, tomando en cuenta que cada lineal celular tuvo su control en cada experimento (estimuladas y no estimuladas). Posteriormente, se les extrajo el ARN mediante con el reactivo Trizol. Se llevaron a cabo técnicas de biología molecular como la PCR en tiempo real y Western Blot para la búsqueda de genes y proteínas de carácter pro-apoptótico en líneas celulares estimuladas y no estimuladas en células sanas y patológicas. Se evaluaron genes que codifican a proteínas como Bax, PUMA, Bim, Citocromo C y SOD2, un gen que codifica para la proteína de carácter antioxidante. En los resultados del estudio que se realizo se detectaron niveles de expresión a nivel de gen que codifican a proteínas antioxidantes, así como la expresión de genes pro apoptóticos en algunos casos favoreciéndose en la presencia de H2O2.

The FoxO subfamily of transcription factors is characterized by a DNA binding domain called the forkhead box. Among them, FoxO3a is one of the transcription factors that is involved in various pathologies such as IPF and NH. In addition, these factors have been shown to play an essential role in various biological processes, including development, proliferation, apoptosis, metabolism, differentiation, and defense against oxidative stress. H2O2 is a short-lived molecule that is generated as a byproduct of cellular respiration, and could function as a specific messenger modifying target molecules or changing the intracellular redox state. In this work, the role of FoxO3a as a regulator in the expression of pro-apoptotic genes in control cells and cells obtained from biopsies of patients diagnosed with IPF and NH that were subjected to a stressful stimulus, using hydrogen peroxide (H2O2) at a concentration and exposure time established to cause oxidative stress, was evaluated. For this purpose, fibroblasts were obtained from biopsies of patients diagnosed with IPF and NH, and control cell line cultures were performed in EMEM culture medium enriched with 10% fetal bovine serum and Primocin antibiotic. Both control and pathological cell lines were stimulated with H2O2, taking into account that each cell line had its control in each experiment (stimulated and non-stimulated). Subsequently, RNA was extracted from them using Trizol reagent. Molecular biology techniques such as real-time PCR and Western Blot were carried out to search for genes and proteins of a pro-apoptotic nature in stimulated and non-stimulated cell lines in healthy and pathological cells. Genes that encode proteins such as Bax, PUMA, Bim, Cytochrome C and SOD2, a gene that encodes for the antioxidant protein, were evaluated. In the results of the study that was carried out, expression levels were detected at the gene level that encode antioxidant proteins, as well as the expression of pro-apoptotic genes in some cases favored by the presence of H2O2.