Estudio de la Participación de CD28 en la Señalización de Macrófagos CD3+, de Origen Humano y Murino

Abstract

Introducción: Los receptores de la célula T son complejos proteicos que por medio de sus cadenas α y β, se asocian al complejo CD3. El complejo formado transmite la señalización intracelular para la activación de estas células. CD28 es un receptor co-estimulador más eficiente para la activación de linfocitos T. En este trabajo se busca evaluar si existe un mecanismo de co-estimulación entre ambos receptores en la línea de macrófagos RAW 264.7, en la cual, se comenzó a identificar la presencia de CD3 en años anteriores. Objetivo general: Evaluar la expresión y funcionalidad de CD28 y CD3 en macrófagos RAW 264.7 CD3+ y en macrófagos derivados de monocitos humanos CD3+ estimulados con anticuerpos específicos para CD3 y CD28. Metodología: Cultivo de células RAW 264.7: Las células fueron cultivadas en medio DMEM suplementado con suero fetal bovino inactivado por calor, penicilina, estreptomicina, piruvato de sodio, glutamina y HEPES, a 37° C, en ambiente humidificado y con 5% de CO2. Cinética de crecimiento de células RAW 264.7: Se incubaron las células RAW con distintos estímulos (RMPI, ANTI-CD3, Control de isotipo, LPS, PMA + Ionomicna) a distintos tiempos de incubación para su posterior recolección de sobrenadante y obtención de ácidos nucleicos. La metodología se llevo a cabo en 2 placas de cultivo, una con un tiempo de incubación de minutos y otra con un tiempo de incubación de horas. Dichos experimentos se realizaron por triplicado. Tinción de inmunofluorescencia de superficie celular: Se tiñeron células RAW 264.7 con anticuerpos específicos para; CD2, CD3, CD14, TCR, CD4 y CD8 para su análisis mediante citometría de flujo. Western Blot: A partir de los ácidos nucleicos obtenidos de la cinética de crecimiento de las células RAW, se realizó un western blot tras la incubación con anticuerpos específicos para STAT-1, NFAT-1, IKK-α, β-Actina, GAPDH y NF-kβ. Conclusión: Según los resultados obtenidos, la co-expresión de CD3 y CD28 en células RAW 264.7 fue despreciable, aunque se mostró cierta expresión de citocinas proinflamatorias por lo que sería precipitado descartar más líneas de investigación. Por ejemplo, puede evaluarse la funcionalidad de la expresión de los marcadores celulares evaluados bajo un modelo infeccioso con M. tuberculosis, que por cuestiones de tiempo no fue posible abarcar en este reporte, también puede evaluarse si existe especificidad del TCR expresado por las células RAW 264.7 en contra de un antígeno y de ser así identificar la fuente de dicho antígeno en el método experimental.