Diseño de un Vector de Clonación para la Expresión de una Proteína Antimicrobiana de Lacp. plantarum en Escherichia coli TOP10

Abstract

Las bacterias ácido lácticas (BAL) como Latiplantibacillus paraplantarum, Lactiplantibacillus plantarum, entre otras de este género son ampliamente utilizadas en la industria alimentaria sobre todo en la producción de alimentos fermentados como yogurt, queso, kimchi, entre otros. Las BAL otorgan características sensoriales a los alimentos como textura y aroma, además de acidez (Tian, 2019). Aunado a esto las BAL son capaces de producir un efecto bioconservador en ciertos alimentos debido a la producción de compuestos antimicrobianos como ácidos orgánicos, ácidos grasos de cadena corta, peróxido de hidrógeno, bacteriocinas, peptidoglicanohidrolasas (PGH) y proteínas ribosomales (RP), estas últimas han presentado recientemente tener potencial antimicrobiano (Hurtado et al, 2022). Se ha demostrado que la resistencia a los antimicrobianos convencionales está incrementando aceleradamente y representa un problema de salud mundial, poniendo en riesgo a la humanidad; es por esto que el estudio de alternativas a estos antimicrobianos es de vital importancia. El objetivo del presente trabajo fue clonar una proteína con potencial antimicrobiano, obtenida de Lacp. plantarum con la finalidad de incrementar su producción y posteriormente llevar a cabo su sobreexpresión y posteriores estudios enfocados a comprender su mecanismo antimicrobiano. Para esto, primeramente, se realizó la identificación de la cepa mediante el gen recA y espectrometría de masas MALDI-TOF-MS, se extrajo ADN genómico de la cepa utilizando un kit comercial, posteriormente se llevó a cabo la amplificación del gen de interés que codifica para la proteína ribosomal con potencial antimicrobiano, RP uL14. Se utilizó el vector de clonación pTWIN1 y la digestión se realizó mediante enzimas de restricción XhoI y NdeI. Para la ligación se utilizó la enzima T4 ADN ligasa, para posteriormente, llevar a cabo la transformación por choque térmico en células de E. coli TOP10. Finalmente, se extrajo ADN plasmídico y se confirmó la clonación mediante PCR con cebadores específicos. Se identificó la cepa de estudio como Lacp. plantarum y se logró amplificar el gen RP uL14, así mismo se logró la ligación del vector con el fragmento de interés. Posteriormente, se obtuvieron colonias transformadas, a las cuales se les extrajo el ADN plasmídico y mediante PCR se obtuvieron amplicones que sugieren la presencia del gen RP uL14 dentro del vector de clonación.