Producción y purificación de una proteína de fase aguda PigMap recombinante como herramienta de diagnóstico de bienestar animal en cerdos.

Abstract

Las proteínas de fase aguda (PFA) se pueden definir como proteínas plasmáticas secretadas en el hígado como respuesta de fase aguda, debido a infecciones, inflamación, daño tisular u otros factores inductores de estrés (O’Reilly et al., 2018). La respuesta de fase aguda se caracteriza por una serie de diferentes efectos sistémicos, actividades metabólicas y alteraciones en una amplia variedad de procesos bioquímicos. La proteína PigMAP es una glicoproteína de fase aguda, la cual es secretada por los cerdos durante un proceso de estrés, daño tisular o bien por infección. Su función biológica aún es desconocida, sin embargo, se ha determinado que tiene un potencial importante como biomarcador de estrés en cerdos, llegando a elevarse de diez a veinte veces su concentración basal en torrente sanguíneo durante procesos de estrés en cerdos. Con esto PigMAP se convierte en una proteína para tener en cuenta para investigaciones que lleve a entender mejor a esta biomolécula y con ello poder tener un mejor panorama en su interacción con patógenos o en procesos fisiológicos de los cerdos (Tóthová et al., 2019; Gulhar et al., 2021). Es por ello el objetivo de este trabajo el producir la proteína PigMAP con base en un sistema de expresión recombinante (E. coli) y su posterior caracterización inmunogénica para su utilización como una herramienta de diagnóstico de bienestar animal. Se realizó la predicción del peso molecular y la estructura terciaria de PigMAP (número de acceso: 7VFRB5X3016) obteniéndose mediante el software PyMol y DNAstar, (DNASTAR), la hidrofobicidad mediante el algoritmo de Kyte-Doolittle, las regiones antigénicas se predijeron mediante el algoritmo de Jameson-Wolf y las regiones transmembranales con el servidor TMHMM Server v. 2.0. Se diseñaron oligos específicos para recuperar los genes correspondientes al N- y C- terminal de PigMAP, estos contenían los epítopos más inmunogénicos y mejores candidatos para clonación y expresión de manera recombinante. Fueron amplificados a partir de cDNA de un bazo de cerdo clínicamente sano y fueron clonados en el vector de resguardo pJET1.2/blunt para su mantenimiento en el laboratorio. La porción que corresponde al N-terminal fue clonado en el vector de resguardo pJET1.2/blunt. A partir de este vector se amplificó y se realizó la ligación al vector de expresión pET SUMO y se efectuó la transformación en células competentes de E. coli. para su caracterización por PCR. Se transformó la cepa de E. coli BL21(DE3) para su inducción por medio de IPGT y su consecuente expresión de la proteína de interés. Finalmente se realizó un SDS-PAGE y Western Blot para su detección en un peso molecular esperado de 37 kDa. La purificación de la proteína fue realizada por medio de cromatografía de afinidad IMAC, detectándose por medio de un SDS- PAGE y Western Blot. La proteína purificada se utilizó como antígeno para inocular ratones de 21 días de la cepa CF-1 divididos de forma aleatoria en tres grupos: grupo inoculado solo con la proteína; otro con la proteína más un adyuvante y el tercer grupo inmunizado por con solución PBS, realizando dos inmunizaciones en día 0 y 14. Se tomaron muestras de suero sanguíneo y se realizó el estudio de inmunogenicidad de dichos sueros por medio de la prueba ELISA. El análisis estadístico se realizó por medio del paquete estadístico NCSS (NCSS, LLC. Kaysville, Utah, USA) y la construcción de los gráficos por medio del programa SygmaPlot 12.5. Mostrando como resultado una respuesta humoral específica inducida por la proteína con una diferencia estadística entre los grupos evaluados.