Estandarización y Evaluación de la Metodología del Western Blot Para Muestras de Trampas Extracelulares de Neutrófilos (NET)

Abstract

La liberación de trampas extracelulares de neutrófilos (NET, por sus siglas en inglés) resulta ser un mecanismo de defensa tanto benéfico como perjudicial para el hospedero, ya que puede desencadenar diversas patologías. Puesto que su análisis resulta ser importante en la investigación médica, se han utilizado técnicas para el estudio de las NET, como el uso del Western Blot (WB) para identificar la presencia de proteínas blanco que conforman a las NET. En el presente proyecto se determinaron las condiciones adecuadas para la identificación de algunas de las proteínas que están presentes en las NET, las cuales fueron Histona H3, Histona 3 citrulinada (citH3), Proteína Arginina-Deiminasa tipo IV (PAD4), Péptido Antimicrobiano de Catelicidina (LL-37) y β-actina, y como controles de carga se utilizaron a la enzima Gliceraldehído-3-fostafo deshidrogenasa (GAPDH) y β-actina. Para su estudio se extrajeron polimorfonucleares (PMN) de individuos sanos mediante venopunción y se estimularon con forbol-12-miristato-13-acetato (PMA) a las 0.5, 1, 2, 3 y 4 horas, teniendo a las 0 horas un control sin estímulo. Las proteínas se separaron mediante electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE) con dodecilsulfato sódico (SDS) y se detectaron por WB mediante el uso de anticuerpos primarios y secundarios de ratón y/o conejo a diferentes títulos, así como su respectivo análisis de densitometría óptica para cada una de las proteínas. Dicho lo anterior, se estandarizaron las concentraciones de anticuerpos para la inmunodetección de proteínas que componen a las NET en el Laboratorio de la Clínica de Vasculitis Sistémicas Primarias del Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias (INER).