Extracción y cuantificación de proteínas de células de la granulosa de bovino en cultivo para estudio de proteómica

Abstract

Visits are made to a particular slaughterhouse to obtain ovaries from slaughtered cows, later they are transferred to the Reproduction Biochemistry laboratory of the Universidad Autónoma Metropolitana Xochimilco Unit to obtain and dissect ovarian follicles in order to eliminate Theca cells and follicular fluid obtaining granulosa cells, then a cell count is performed and cultured in 96-well plates with a lid (Thermoscientific, NUNC sterile, 16008), in modified McCoys 5ª culture medium. The treatments are distributed in 48 wells with IGF-1 and 48 wells without IGF-1, having a control group and a group adding 1ng/ml of FSH incubating in an atmosphere of 5% CO2 at 37° and 90% of humidity. The determination of the number of viable cells is performed by MTT assay and subsequently an ELISA assay is performed. Cellular processes in the ovarian follicle are regulated by gonadotropins, growth factors, and steroids. FSH is directly involved in different granulosa cell events. The results obtained indicated that FSH increased estradiol production and viability in bovine GC in medium supplemented with and without IGF-1. There were no significant differences between the use of medium supplemented or not with IGF-1 in GC stimulated with FSH because the concentrations used are basal, therefore, a marked effect on the viability and steroidogenesis of these cells is not perceived.

Se realizan visitas a un rastro particular para obtener ovarios de vacas sacrificadas, posteriormente se trasladan al laboratorio de Bioquímica de la reproducción de la Universidad Autónoma Metropolitana Unidad Xochimilco para obtener y diseccionar folículos ováricos con el fin de eliminar células de la Teca y líquido folicular obteniendo las células de la granulosa, después se realiza un conteo celular y se cultivan en placas de 96 pozos con tapa (Thermoscientific, NUNC estéril, 16008), en medio de cultivo McCoy’s 5ª modificado. Los tratamientos se distribuyen en 48 pozos con IGF-1 y 48 pozos sin IGF-1 teniendo grupo control y un grupo adicionando 1ng/ml de FSH incubando en una atmósfera de 5% de CO2 a 37° y 90% de húmedad. Se realiza la determinación del número de células viables mediante ensayo MTT y posteriormente se realiza un ensayo ELISA. Los procesos celulares en el folículo ovárico son regulados por gonadotropinas, por factores de crecimiento y por esteroides. FSH está involucrada directamente en diferentes eventos de las células de la granulosa. Los resultados obtenidos indicaron que FSH incrementó la producción de estradiol y la viabilidad en CG de bovino en medio suplementado con y sin IGF-1. No hubo diferencias significativas entre el uso del medio suplentado o no con IGF-1 en CG estimuladas con FSH debido a que las concentraciones empleadas son basales, por lo tanto, no se percibe un efecto marcado sobre la viabilidad y la esteroidogénesis de estas células.