Obtención y purificación de proteínas de la placenta de la especie ovina (ovis aries) asociadas a la gestación

Abstract

En rumiantes, las glicoproteínas asociadas a la gestación (PAG) se han utilizado como herramientas para diagnóstico de preñez. El objetivo del presente estudio fue identificar y aislar formas de las PAG´s de placenta ovina de 100 días de gestación. Las proteínas presentes en el extracto placentario se precipitaron con sulfato de amonio al 40% y 80% de saturación, fracciones llamadas PAG40 y PAG80, respectivamente. Cada fracción proteica se purificó en el intercambiador iónico DEAE-SEPHACEL (pH 7.6) con un gradiente de NaCl (0 a 1.0 M). La fracción de proteína proveniente de PAG40 y recuperada con 80 mM de NaCl (PAG 40-80 mM) se envió a secuenciación y se analizó por medio de la inmunotransferencia. La fracción PAG80 recuperada con 320 mM de NaCl (PAG80-320 mM) se repurificó en una cromatografía de CM-Sepharosa (pH 5.2) bajo un gradiente de NaCl (0 - 1.0 M); las fracciones recuperadas de esta cromatografía se analizaron por medio de la inmunotransferencia. El análisis de la secuenciación de la fracción PAG 40-80 mM confirmo la presencia de tres isoformas de PAG con un peso molecular teórico de 42.7, 42.5 y 43.5 Kilodaltones, respectivamente. El análisis inmunoelectroforético denoto bajo condiciones no reducidas la presencia de proteínas de alto peso molecular relativo (100 a 130 kDa), y bajo condiciones reducidas (en presencia βmercaptoetanol) estas glicoproteínas desaparecieron significativamente y se enriquecieron las proteínas con peso molecular de 54 y 28 kDa y bandas de proteínas menos visibles de 62, 60, 43 y 42 kDa. La fracción PAG 80-320 mM mostró un patrón de proteínas de 100 a 40 kDa con un predominio de la proteína de 42 kDa en la fracción de proteína no retenida y de la eluida a 160 y 320 mM de NaCl se observó el predominio de la forma de 55 kDa. Bajo las condiciones de extracción y purificación desarrollados en este estudio es logró identificar y aislar proteínas similares a PAG`s.