Expresión de la proteína recombinante apisimina y su caracterización

Abstract

Apisimin is a royal jelly peptide from Apis mellifera that participates in molecular complexes with major royal jelly protein 1 (MRJP1). Mature apisimin contains 54 amino acids, whereas the reference transcript used in this study encodes a 78-amino-acid precursor. This project aimed to develop constructs for heterologous expression and to characterize the predicted recombinant product at the molecular and bioinformatic levels. Three strategies, UTR, 2RBS, and PRB, were designed. RNA from nurse-bee head tissue was reverse-transcribed into complementary DNA; the target regions were amplified and processed for cloning into pET-22b(+). UTR and 2RBS yielded selected constructs for Sanger sequencing and reconstruction in ApE, while PRB did not yield a clone suitable for further analysis. The 78-amino-acid query sequence showed 100% identity and query coverage with the A. mellifera apisimin precursor (NP_001011582.1) in BLASTp. The analyzed construct predicted an 86-amino-acid recombinant product comprising the apisimin precursor, two residues derived from XhoI, and a C-terminal 6×His tag. ProtParam estimated a molecular mass of 9011.51 Da and a theoretical isoelectric point of 6.25. Predictive three-dimensional models and exploratory induction assays in Escherichia coli BL21(DE3) were also obtained. However, SDS-PAGE did not allow unequivocal assignment of a band to the expected 9.01-kDa product. These results establish constructs and a molecular and computational basis for subsequent identification and purification of recombinant apisimin

La apisimina es un péptido de la jalea real de Apis mellifera que participa en la organización de complejos con la proteína mayoritaria de la jalea real 1 (MRJP1). La forma madura contiene 54 aminoácidos, mientras que el transcrito de referencia utilizado en este trabajo codifica un precursor de 78 aminoácidos. El objetivo fue desarrollar construcciones dirigidas a su expresión heteróloga y caracterizar molecular y bioinformáticamente el producto recombinante predicho. Se diseñaron tres estrategias, UTR, 2RBS y PRB. A partir de ARN extraído de tejido cefálico de abejas nodrizas se sintetizó ADN complementario, se amplificaron las regiones de interés y se procesaron los productos para su clonación en pET-22b(+). Las estrategias UTR y 2RBS permitieron recuperar construcciones seleccionadas para secuenciación Sanger y reconstrucción en ApE; PRB no produjo una clona adecuada para continuar. La secuencia proteica de 78 aminoácidos utilizada en BLASTp presentó identidad y cobertura de 100% con el precursor de apisimina de A. mellifera (NP_001011582.1). La construcción analizada predijo un producto de 86 aminoácidos —precursor de apisimina, dos residuos derivados de XhoI y etiqueta 6×His—, con masa teórica de 9011.51 Da y punto isoeléctrico de 6.25 mediante ProtParam. Se obtuvieron modelos tridimensionales predictivos y se realizaron ensayos exploratorios de inducción en Escherichia coli BL21(DE3); sin embargo, SDS-PAGE no permitió asignar de forma inequívoca una banda al producto esperado de 9.01 kDa. El trabajo aporta construcciones y una base de caracterización molecular y computacional para avanzar hacia la identificación y purificación de apisimina recombinante