Estandarización de técnica para cuantificación de biopelículas de Pseudomonas aeruginosa por cristal violeta

Abstract

El informe aborda la estandarización de la técnica de cristal violeta para la cuantificación de biopelículas de Pseudomonas aeruginosa, una bacteria Gram negativa reconocida por su alta capacidad para formar biopelículas robustas, asociadas con infecciones persistentes y resistencia a antimicrobianos. Estas biopelículas constituyen una matriz extracelular protectora que favorece la adhesión bacteriana, la colonización de superficies y la supervivencia en condiciones adversas, lo que representa un desafío en ámbitos clínicos e industriales. El trabajo parte de la problemática de que, aunque la tinción con cristal violeta es una de las técnicas más utilizadas para cuantificar biomasa adherida por su bajo costo y simplicidad, presenta alta variabilidad experimental debido a factores como la densidad del inóculo, el tiempo de incubación, los métodos de lavado, la concentración del colorante y la longitud de onda de lectura. Esta falta de uniformidad dificulta la reproducibilidad y comparación entre estudios. Metodológicamente, se cultivó P. aeruginosa en medio BHI, se realizaron diluciones seriadas para determinar densidad óptica y cuenta viable, y posteriormente se inocularon microplacas de 96 pozos con diferentes concentraciones bacterianas. Tras incubación, se aplicó un protocolo de lavado con PBS, tinción con cristal violeta al 0.1 %, solubilización con ácido acético y lectura espectrofotométrica a 550 nm para cuantificar la biomasa. Los resultados confirmaron la correcta identificación bacteriana tanto macroscópica como microscópicamente; sin embargo, la cuantificación de biopelículas no mostró una relación consistente entre concentración bacteriana y formación de biomasa, obteniéndose valores heterogéneos y poco representativos. En la discusión se atribuye esta variabilidad principalmente a errores metodológicos durante el lavado y la tinción, así como a la ausencia de pasos críticos, como la fijación previa con etanol o metanol. Se concluye que, aunque se logró desarrollar completamente la metodología experimental, la técnica requiere mayor control de variables y reducción del error humano para obtener resultados reproducibles. Además, se recomienda complementar o sustituir el cristal violeta con métodos alternativos, como fluorescencia o bioluminiscencia, que ofrecen mayor precisión y confiabilidad.